花生紅衣作為花生生產過程中價值極低的副產物,除了用于動物飼料外,大部分被當作廢棄物而造成資源浪費。近些年研究發(fā)現(xiàn),花生紅衣中富含多酚類物質,具有很高的營養(yǎng)和利用價值?;ㄉt衣中多酚類物質含量為90~125mg/g,包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質,其中原花青素占花生紅衣總質量的17%,約有50%為生物活性較高的低聚體。原花青素具有較強的抗氧化能力,可作為防癌、防治心血管疾病藥物的主要有效成分,可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑。目前,市場上原花青素產品大部分是葡萄籽來源的原花青素,葡萄籽中只含有B型原花青素,其聚合度較高,平均聚合度可達14.3。近年來研究較多的花生紅衣富含A型原花青素,聚合度較低,平均聚合度為3.2。研究發(fā)現(xiàn)只有低聚體原花青素(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收,A型與B型原花青素在人體內發(fā)揮的作用不同。鑒于花生紅衣與葡萄籽來源的原花青素不同,有待于開發(fā)花生紅衣來源的原花青素產品。
不同純度的原花青素在食品、保健品、藥品以及化妝品等領域有一定的應用,市場對其純度的需求也不同。目前分離純化方法主要有溶劑萃取法、層析法、液相制備色譜等,但大孔樹脂法應用最為廣泛,其設備簡單、操作方便、便于工業(yè)化生產。本文采用大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素進行分離純化,并用HPLC-MS對純化產物進行分析鑒定。
花生紅衣原花青素的提取
用小型高速粉碎機將花生紅衣粉碎至過40目篩,每千克花生紅衣采用10L石油醚去除脂類物質,于30℃恒溫水浴鍋中脫脂5h,抽濾,濾渣置于通風櫥中去除石油醚,保存在干燥器中備用。每千克脫脂花生紅衣采用10L體積分數(shù)為70%的乙醇溶液提取,在超聲功率120W、超聲溫度35℃的條件下,超聲提取10min,相同條件下提取3次。合并過濾得到的濾液,旋轉蒸發(fā)至干,得到花生紅衣原花青素粗提物。
大孔吸附樹脂純化花生紅衣原花青素
大孔吸附樹脂的預處理
大孔吸附樹脂常含有一些單體、分散劑和致孔劑等,使用時需要除去這些有毒的有機殘留物,所以必須經(jīng)過預處理。預處理方法:無水乙醇浸泡24h→用無水乙醇洗至流出液與水1∶5不渾濁→用去離子水洗至無醇味→5%HCl溶液浸泡2~4h→用去離子水洗至流出液為中性→2%NaOH溶液浸泡2~4h→去離子水洗至流出液為中性,備用。
大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗
將經(jīng)預處理后的大孔吸附樹脂抽濾并吸干其表面水分,準確稱取4種預處理后的樹脂1g分別置于25mL具塞錐形瓶中,各加入10mL(質量濃度為5.02mg/mL)花生紅衣原花青素粗提液,搖勻,放入氣浴恒溫振蕩器中,振蕩速率為120r/min,溫度為30℃。在0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24h時吸取上清液,測定上清液中原花青素的含量,并以吸附量對時間作圖,得到各樹脂的吸附動力學曲線。過濾吸附飽和的樹脂,分別加入20mL95%乙醇,在氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h,過濾解吸液,測定其中原花青素含量。按下式計算吸附率、吸附量和解吸率。
(1)吸附率=(C0-C1)/C0×100%
(2)吸附量=(C0-C1)×V1/m
(3)解吸率=C2×V2/(C0-C1)×V1×100%
式中:C0為花生紅衣原花青素粗提液質量濃度,mg/mL;C1為經(jīng)樹脂吸附后上清液中原花青素質量濃度,mg/mL;C2為原花青素解吸液質量濃度,mg/mL;V1為經(jīng)樹脂吸附后上清液體積,mL;V2為原花青素解吸液體積,mL;m為干樹脂質量,g。
大孔樹脂AB-8純化花生紅衣原花青素
稱取已處理的AB-8大孔吸附樹脂裝填入層析柱,將一定質量濃度的花生紅衣原花青素粗提液(以澄清為好)上柱,柱溫為室溫;洗脫時首先用4BV蒸餾水洗去相對分子質量較大的蛋白質、多糖等雜質;然后用4BV不同體積分數(shù)的乙醇溶液將吸附在樹脂上的原花青素梯度洗脫下來,分批收集流出液,旋轉蒸發(fā)至干,得到原花青素純化物。接下式計算產物原花青素的純度和回收率。
(4)純度=純化物中原花青素質量/純化物質量×100%
(5)回收率=洗脫液體積×洗脫液中原花青素質量濃度/(上樣液體積×上樣液中原花青素質量濃度)×100%
原花青素的測定
原花青素標準曲線的繪制
準確稱取0.0500g原花青素標準品,加甲醇溶解并定容至25mL,得到2.0mg/mL的原花青素標準溶液(現(xiàn)配)。分別精確量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL原花青素標準溶液于10mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度線,此時得到質量濃度分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mg/mL的工作溶液。再各取1mL工作溶液于10mL試管中,分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液,3mL濃鹽酸,搖勻,在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min,取出,在500nm波長下測定其吸光度,繪制標準曲線?;貧w方程為Y=1.3306X+0.0664,R2=0.9966。
花生紅衣原花青素的測定
取1mL稀釋了一定倍數(shù)的花生紅衣原花青素粗提液,分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液,3mL濃鹽酸,搖勻,在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min,取出,在500nm波長下測定其吸光度,由標準曲線回歸方程可計算樣品中原花青素的質量濃度。
1.2.4HPLC-MS測定花生紅衣原花青素
將洗脫級分10mg分別溶于10mL色譜純甲醇中,經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進行HPLC-MS分析。
色譜條件:色譜柱為CSH柱(2.1mm×100mm,粒徑1.9μm);流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水溶液;柱溫45℃;進樣量1μL;流動相洗脫條件為0~0.1min,5%A;0.1~30min,5%~20%A;30~32min,20%~80%A;32~32.5min,80%~5%A;32.5~35min,5%A。
質譜條件:ESI電離源,負離子模式;毛細管電壓3.0kV,錐孔電壓40.0V;離子源溫度100℃,脫溶劑溫度400℃;錐孔氣流速50.0L/h,脫溶劑氣流速700.0L/h;碰撞電壓6V;相對分子質量掃描范圍(m/z)50~2000。
2結果與討論
2.14種大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素的靜態(tài)吸附率和解吸率
大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩原理相結合的分離介質,其吸附力與吸附樹脂和吸附質之間的范德華力和氫鍵作用有關。本試驗所用大孔吸附樹脂包括極性樹脂(NKA-9)、中極性樹脂(HPD750)、弱極性樹脂(AB-8)和非極性樹脂(D101):
NKA-9和AB-8大孔吸附樹脂對原花青素均有較大的吸附率,D101大孔吸附樹脂的吸附率低于其他大孔吸附樹脂。原花青素分子中含有多個酚羥基,可形成氫鍵,具有一定的親水性和極性,容易被極性、中極性和弱極性樹脂吸附。除此之外,大孔吸附樹脂的吸附能力還與其孔隙結構、比表面積等有關。HPD750比表面積大,孔徑小,不利于原花青素分子通過樹脂的孔徑擴散到其內表面而被吸附。NKA-9表面極性大,對原花青素分子產生強烈吸附,會阻礙原花青素的解吸。大孔吸附樹脂的靜態(tài)動力學曲線一般可以分為兩種類型:第1種是快速平衡型,其特征是在吸附的起始階段吸附量迅速增加,很快達到吸附平衡;第2種是慢速平衡型,起始階段吸附量較小,吸附量的上升速度緩慢,吸附平衡時間較長。AB-8、NKA-9、D101樹脂對原花青素的吸附屬于快速平衡型,而HPD750則屬于慢速平衡型。因此,綜合考慮樹脂吸附量、解吸率以及靜態(tài)吸附動力學特征發(fā)現(xiàn),AB-8大孔樹脂吸附量大、解吸容易并可以較快達到吸附平衡,故選用AB-8大孔吸附樹脂作為分離純化花生紅衣原花青素的吸附材料。
上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響
上樣流速小,樣液中溶質與樹脂接觸時間長,其吸附較為完全;流速過大,溶質分子來不及擴散到樹脂的內表面進行吸附,導致吸附不充分,且浪費了樣品。因此,本試驗研究上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響:
上樣流速為0.25mL/min和0.5mL/min時,大孔樹脂對原花青素的吸附率比較高,泄漏時間分別出現(xiàn)在250min和180min。當上樣流速為0.75mL/min和1.0mL/min時,泄漏時間出現(xiàn)較早,吸附過程不完全??紤]到實際的生產情況,選取0.5mL/min上樣流速較為合適。
洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響
為了使洗脫液與AB-8大孔吸附樹脂所吸附的溶質有充分的接觸時間,進行有效地解吸,必須使洗脫液以合適的流速進行洗脫,因此考察了洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響:
洗脫流速為0.5mL/min和1.0mL/min時,洗脫效果相差不大,而當洗脫流速達到2.0mL/min以上時,洗脫效果明顯變差,原花青素純度也呈下降趨勢。因此,選擇洗脫流速為1.0mL/min,此時原花青素的解吸率為89.31%,純度為98.7%。
不同體積分數(shù)乙醇對原花青素的洗脫效果
大孔吸附樹脂進行分離純化時常用的洗脫劑為乙醇溶液,不同體積分數(shù)乙醇溶液的極性不同,其對原花青素的洗脫能力也有所差異,因此本試驗研究了不同體積分數(shù)乙醇溶液對原花青素的洗脫效果的影響:
乙醇體積分數(shù)對花生紅衣原花青素的洗脫曲線有很大的影響,其中40%乙醇溶液的洗脫曲線峰值最高,在0.8~2.5BV范圍內收集到的原花青素質量濃度相對較高。20%乙醇溶液對原花青素的洗脫效果較好,洗脫曲線有明顯的峰值,稍有拖尾現(xiàn)象。10%和95%乙醇溶液對原花青素洗脫能力差,洗脫曲線無明顯峰值。因此,可以通過收集不同范圍內的洗脫液來制備不同純度的原花青素。
洗脫方式或收集方式對原花青素解吸效果的影響
原花青素是由不同聚合度的兒茶素或表兒茶素組成的混合物,含有大量的酚羥基,樹脂吸附過程中極有可能發(fā)生氫鍵吸附,則不同聚合度的原花青素被吸附和解吸的過程和速度必然存在差異。因此,梯度洗脫極有可能獲得聚合度不同或純度不同的原花青素。列出不同體積分數(shù)乙醇洗脫收集到4種原花青素的解吸效果:
采用20%乙醇溶液進行洗脫得到的原花青素的純度最高,采用40%乙醇溶液進行洗脫,原花青素的回收率******。因此,選擇20%和40%乙醇作為制備原花青素的洗脫劑。
另將20%和40%乙醇的洗脫液分別收集:
20%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少,純度從低到高再到低,在約2~3.5BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高,占總干重的23.4%;40%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少,純度從高到低,在約0~2BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高,占總干重的84.2%。
在工業(yè)生產中可根據(jù)產品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。當用20%乙醇進行洗脫時,收集2~3.5BV洗脫液可得到純度大于98%的原花青素,收集0~4BV洗脫液時可得到純度大于95%的原花青素;當用40%乙醇洗脫時,收集0~2BV洗脫液可得到純度85%~90%的原花青素,收集0~4BV洗脫液可得到純度約為80%的原花青素。
6HPLC-MS對花生紅衣原花青素純化物的分析結果
經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素,20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體,40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。研究發(fā)現(xiàn)只有低相對分子質量低聚體(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收。因此,試驗所制備的花生紅衣原花青素因其相對分子質量小,易于被人體吸收,在人體內可充分發(fā)揮其生理功能。
3結論
研究了AB-8大孔吸附樹脂分離純化得到不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝。******分離純化條件為:上樣流速0.5mL/min,洗脫流速1.0mL/min,洗脫液20%和40%乙醇溶液。解吸后得到20%乙醇純化物和40%乙醇純化物,20%乙醇純化物純度最高,可達98.7%,回收率較低,為29.41%,40%乙醇純化物純度為86.2%,回收率較高,為5031%。通過不同的收集方式可得到不同純度的原花青素,因此在工業(yè)生產中可根據(jù)產品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。
由HPLC-MS分析可知,經(jīng)AB-8大孔樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素,20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體,40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。